素合子

Reviews:对调控因子的调节:RAS的翻译后修饰(上) 文献翻译Nature

作者:杨爱民课题组CQU / 关注公众号:YangLab_ChemBio_CQU  发布:2019-10-01

摘要:
RAS蛋白是单分子GTPases,作为二元(binary)分子开关调控多种细胞过程。GTP与GDP在RAS上的交换受鸟嘌呤核苷酸交换因子(GEFs)和GTPase活化蛋白(gap)的调控,它们在不共价修饰RAS的情况下调控RAS的活化状态。与此相反,RAS蛋白的翻译后修饰(PTMs)将它们导向不同的细胞膜,在某些情况下,还调节GTP-GDP的交换。重要的RAS PTMs包括对C段CAAX 序列的组成性和不可逆的改造,包括法尼酰化,蛋白质水解和甲基化,可逆棕榈酰化,和条件修饰(磷酸化,肽基-脯氨酰异构化,单体泛素化, 双泛素化,亚硝基化,ADP核糖基化和糖基化)。
引言:
癌症研究人员和细胞生物学家对RAS的作用和调控是从v RAS基因作被发现参与肿瘤病毒转化原理,以及从HRAS作为致癌因子首先从人类肿瘤中分离出来而开始的。最近对癌症基因组的分析再次证实了RAS基因在几种人类肿瘤中作为致癌因子的作用很关键。此外,最近发现RAS基因的种系突变是导致三种精神疾病(Costello综合征、Noonan综合征和cardio-facio- skin综合征)发生的潜在原因,这进一步证明了RAS突变与疾病之间的联系。
对于细胞生物学家来说,RAS是单分子GTPase开关的典型,它根据其结合的鸟嘌呤核苷酸以两种状态存在。RAS作为一个二元开关,调控着信息(沿着几个信号通路)的流动(FIG. 1)。这类蛋白质以CAAX序列结束,其中C是Cys, A通常是(但不总是)脂肪族氨基酸,X可以是任何氨基酸。CAAX序列通过多异戊二烯类脂质对蛋白质的羧基端进行翻译后修饰(PTM),对于RAS,这种修饰往往是法尼基的修饰。这种修饰将原本是球状的亲水蛋白转化为一种与细胞膜胞质小叶相关的蛋白,这是RAS激活和信号传导所必需的过程。
在进行RAS细胞生物学研究的头二十年中,对GTP与GDP在该蛋白上的交换如何受鸟嘌呤核苷酸交换因子(GEFs)和GTPase激活蛋白(gap)调控的理解呈指数级增长(图1a)。我们现在知道GEFs通过诱导GTP的释放和允许GTP结合来激活RAS,而GAP通过增加GTP水解速率使蛋白质返回到GDP结合状态来灭活像RAS这样的小GTPases。此外,科学家们还研究了RAS调控的效应因子和下游通路,以及修饰以RAS为靶点的C末端高变区(HVR)的酶,这种酶能将RAS靶定到膜上。通过在体内和培养细胞中进行的实验,对RAS生物学有了更深入的了解。例如,转基因小鼠的产生证实了细胞生物学家和癌症遗传学家已经怀疑的事实:RAS异构体之间存在显著的生物学差异。此外,虽然RAS最初认为是在质膜上表达的,其信号都来自于质膜, 然而活细胞成像的荧光标记的RAS蛋白显示,RAS在各种亚细胞器之间运输,包括高尔基体和核内体,它能够从多个位置发出信号。很显然,PTMs调控了RAS蛋白的定位(框1)。这些包括修改的C末端HVRs的RAS被研究了二十年,例如磷酸化、亚硝基化,泛素化和肽基脯酰胺异构化修饰。
RAS与其无数GEFs、GAP和效应器之间的相互作用(图1c)已经成为众多讨论的焦点,这里不详细讨论。相反,这篇综述关注的是主要负责RAS蛋白转运和定位的PTMs。这些PTMs为开发小分子抑制剂提供了靶点,这些小分子抑制剂可能会限制RAS活性,因此可用于治疗信号失调的多种疾病,包括癌症。
RAS是一个分子开关
哺乳动物基因组中有三种RAS基因:HRAS、NRAS和KRAS。由于KRAS位点的转录可以选择性剪接,这三个基因产生了四种蛋白亚型:HRAS、NRAS、KRAS4A和KRAS4B。这些蛋白在前168-169个氨基酸(称为G结构域)中有>90%都相同,但在C末端20个氨基酸中有所不同,这些氨基酸被称为HVR(图2a)。每个RAS蛋白都是一个21 kDa的鸟嘌呤核苷酸结合蛋白,含有内在的GTPase活性,因此被认为是一个小或单体的GTPase。RAS蛋白的区分基于α亚基异源三聚体 G蛋白。当GTP被鸟嘌呤核苷酸结合囊内的GDP取代时,RAS蛋白的一个表面,即开关I和开关II区域的构象发生了根本性的变化。这是分子开关的物理基础,而分子开关是RAS作为调节机器的核心。RAS蛋白只有在GTP结合构象中才能通过与效应子的相互作用传递信号。因此,由RAS控制的开关信号最终由启动GTP-GDP交换的因素和影响其GTPase活性的因素决定。RAS蛋白由GEFs激活,其中8个编码于哺乳动物基因组中,包括sevenless (SOS)和RAS特异性鸟嘌呤核苷酸释放因子(RASGRF)之子的两种亚型,以及RAS特异性鸟嘌呤核苷酸释放蛋白(RASGRP)的四种亚型(图1c)。每个GEF包含一个CDC25同源区,这是刺激GDP释放的催化域。GDP的释放促进了GTP的结合,因为GTP在胞质中的含量是GDP的10倍。由于SOS在RAS – 分裂素激活的蛋白激酶(MAPK)通路中的作用已被确定,因此SOS是RAS特异性GEF (RASGEF)的最佳表征。SOS结合既定的适配器(adaptor)蛋白生长因子受体2 (GRB2),并通过适配器的SH2域蛋白,将复合体带到质膜上的酪氨酸激酶受体(PTKRs)上,该受体已由特定的酪氨酸残基磷酸化激活胞质域(图1 b)。GRB2-SOS复合物从胞质转移到与之相关的PTKR膜上,这得益于SOS的plextrin同源性(PH)和组蛋白同源域,它们都与带负电荷的磷脂结合。
RAS的固有GTPase活性很弱(kcat≈2×10-4 s-1)。通过GAPs的作用,催化速率可以提高到原来的105倍,也正是这种蛋白质负调控RAS并限制信号传递。哺乳动物基因组编码7个RAS特异性GAPs (RASGAP),其中研究最好的是p120 RASGAP(也称为RASA1)和神经纤维蛋白。其余为突触RASGAP (SYNGAP)、GAP1m(也称为RASA2)、GAP1 InsP4结合蛋白(GAP1IP4BP;又称RASA3)和两个钙调节GAPs,钙促进RAS失活剂(CAPRI;也称为RASA4)和RASGAP激活类似(RASAL)。RASGAPs通过稳定GTP上的亲核攻击的水的过渡态的发挥作用。他们通过将一个“Arg手指”插入GTPase的活动位置来实现这一功能。RAS基因的致癌突变,如普遍存在的Gly12Val突变,阻止GAP蛋白增加GTPase的催化速率,从而将RAS锁定在GTP结合状态。
RAS的分子和细胞效应
RAS调控许多细胞功能,包括基因表达、增殖、存活、分化、细胞周期进入和细胞骨架动力学。这些细胞功能失调是癌症的一个特征。RAS蛋白的生物学效应是由它们调控的途径决定的,而这些途径又由它们相互作用的效应因子决定。同时进行的生化研究证实,果蝇黑腹果蝇和秀丽隐杆线虫的遗传研究证实,RAF1是已知的第一个RAS效应因子。RAF1是MAPK级联中的第一个激酶,它通过活化MAPK/ERK激酶(MEK;也称为MAPKK)和细胞外信号调节激酶(ERK)(图1b)。许多研究表明,从胸腺T淋巴细胞的负性选择(negative selection)到上皮细胞的增殖,这一途径在各种生物过程中都发挥着重要作用。RAS - mapk通路在许多癌症中的中心作用已被证实,这一级联中的多个节点已被确定为自然发生的癌基因,包括编码表皮生长因子受体(EGFR)、RAS、RAF和ETS的基因突变形式。
除RAF1外,至少有6个家族的蛋白被证明与RAS以GTP依赖的方式相互作用,因此也被认为是效应蛋白(图1c)。其中,磷脂酰肌肽3激酶(PI3K)和一类RAL特异性GEFs(包括RAL鸟嘌呤核苷酸解离刺激因子(RALGDS))的研究最为广泛。这些效应分子促进肿瘤发生的能力,部分是由于这些蛋白的突变形式本身就是癌蛋白。此外,它们促进肿瘤发生的能力已在动物模型中得到证实。例如,缺乏RALGDS的老鼠可以预防RAS引起的皮肤癌。敲除PI3K p110α等位基因纯合子小鼠缺乏RAS结合域以避免KRAS4B诱导的肺肿瘤。另一个重要的RAS效应因子是T淋巴瘤侵袭转移诱导1 (TIAM1),这是一种RAC特异性GEF,将RAS信号连接到RAC36, RAC36是一种RHO家族GTPase,调控肌动蛋白细胞骨架,激活p21激活激酶(PAKs)和JUN N末端激酶(JNK)。最后,磷脂酶Cε(PLCε)是一个RAS效应器(effector),使RAS直接刺激第二信使甘油二酯和钙的产生。尽管TIAM1和PLCε不是原型癌基因蛋白,沉默编码这两种效应物的基因改善了在模型小鼠皮肤肿瘤上HRAS驱动的肿瘤发生。
从这一简要的概述,应该很明显,RAS是一个丰富的信号分子,涉及正常细胞内稳态和病理条件。因此,调控RAS蛋白的PTMs在正常生理和疾病中都具有重要意义
组成性PTMs调控RAS
除了GTP结合外,RAS蛋白还必须与细胞膜结合才能传递信号。膜缔合(Membrane association)在两个维度上限制了RAS,从而极大地促进了RAS与GEFs和gap的相互作用。事实上,RASGEFs主要是通过与膜蛋白(例如SH2)或膜磷脂(例如PH)结合的结构域转移到膜上而调控的。激活的RAS趁此招募它的效应器膜。对于RAF1,膜本身通过一种未知的机制参与其激活。因此,RAS不仅是RAF1激酶的变构再生因子,也是该蛋白的膜系物(membrane tether)。新生RAS是一种球形亲水性蛋白,其与细胞膜的联系是通过一系列的PTMs介导的,其中一些是组成性的,翻译后立即发生,而另一些是有条件的。组成性PTMs将在这里讨论,条件性PTMs将在下一节中讨论。
CAAX处理:异戊烯化、蛋白水解和甲基化
RAS是CAAX蛋白这一大类蛋白质中的一员。CAAX序列被三种依次起作用的酶所修饰。首先,未经修饰的CAAX序列作为底物,由两个胞质异戊烯转移酶中的一个进行异戊烯化。如果X位置的氨基酸是亮氨酸,对于大多数一样RHO家族gtpase和γ亚基异源三聚体G蛋白质,然后香叶香叶酰转移酶 I型(GGTase I) 通过稳定的硫醚键添加一个20碳聚异戊二烯脂质到CAAX半胱氨酸。RHO蛋白的香叶酰香叶酰化不仅使它们与细胞膜结合,并在细胞膜上发挥其生物学作用,而且还促进它们与RHO特异性GDP解离抑制剂(RHOGDI)的结合。由于RHOGDI具有一个疏水口袋,香叶酰香叶酰脂质被隔离到其中,它可以调节膜内外RHO蛋白的转运。如果CAAX X位置上的氨基酸不像所有RAS蛋白一样是Le,那么法尼酰转移酶 (FTase)会用15个碳的法尼酰脂质修饰CAAX 半胱氨酸(图2b)。法尼酰化使RAS蛋白对细胞膜的亲和力相对较弱。类似于RHOGDI几个通过结合蛋白,如磷酸二酯酶δ(PDEδ),描述了可能促进运输法尼酰化蛋白质。
像RAS这样的蛋白质,只在内质网(ER)的细胞质表面积累法尼酰脂质,在那里它们遇到下一个CAAX处理酶,RAS转化酶1 (RCE1)。RAS 异戊烯化是RCE1作用的先决条件,不仅因为它是RAS和RCE1在ER上共域化所必需的,还因为这种蛋白酶的底物特异性。RCE1是一种去除AAX氨基酸的内蛋白酶,因此法尼半胱氨酸是新的C端。RAS酶随后由另一个ER修饰酶异戊烯半胱氨酸羧甲基转移酶 (ICMT)修饰,它起到催化法尼酰半胱氨酸α羧基的甲基酯化作用。在这三种修饰中,只有ICMT催化的修饰是可逆的(图2b)。这三种修饰的最终结果是将RAS蛋白的C端从亲水区域重构为疏水区域,能够插入细胞膜,是RAS蛋白生物活性的必要条件。
没有证据表明CAAX处理与细胞活化、代谢状态或细胞周期有关,这表明它是一个“管家”过程。需要注意的是,最近对SMGGDS剪接变体(一种GEF,对多种小GTPases都有活性)与异戊烯化RAS的结合的描述,表明了一种调控模式。两类药物可以阻止异戊烯化 RAS和其他蛋白质:他汀类药物,抑制3-羟基-3- 甲基戊二酰辅酶a (HMG - CoA),因此限制了法尼酰焦磷酸盐的可用性 (由HMG - CoA还原酶介导的胆固醇生物合成途径的中间产物),另外FTIs抑制剂(FTIs)也直接抑制了法尼酰化。未加工的内源性RAS在缺乏酰化抑制药物的情况下尚未被充分研究。CAAX序列的三个顺序PTMs处理过的RAS与未处理过的RAS可以通过SDS-PAGE进行区分,因为处理过的形式具有稍快的电泳迁移率。内源性RAS未经处理的形式只能在他汀类或FTIs处理后在SDS-PAGE中观察到。与这些结果一致的是,虽然内源性RAS很容易在使用他汀类药物或FTI处理的细胞的胞质碎片中检测到,但绝大多数RAS存在于未经处理的细胞的膜碎片中。这些发现推翻了一组等待处理的未处理RAS,该观点表明CAAX处理以一种有效和构成的方式紧随翻译之后。然而, CAAX的加工过程是饱和的:电泳迁移率和亚细胞分馏的结果表明,当RAS过表达时,一个重要的细胞池并未被处理。
虽然CAAX处理对于RAS蛋白向质膜的传递及其与质膜的稳定结合是必要的,但对这些事件还不够。HVR中CAAX序列上游的元件也是必需的。这些元素被称为质膜靶向的“第二信号”。第二个信号有两种类型:一种由Cys残基组成,Cys残基作为棕榈酰化的受体位点(见于HRAS、NRAS和KRAS4A),另一种由富含Lys残基的多碱性区域组成(见于KRAS4B)(图2a)。
棕榈酰化是第二个信号
脂肪酸酰基链与蛋白质的共价结合称为蛋白质酰化。虽然酰基链的长度不同,但已被证明被纳入蛋白质,14碳肉豆蔻酰基链和16碳棕榈酰链是最常用的。肉豆蔻酰化主要局限于蛋白质的氨基端,而Cys残基的棕榈酰化则发生在整个多肽链上。RAS的棕榈酰化在25年前首次被发现,后来人们认识到这种PTM具有亚型特异性。HRAS有两个Cys残基可以接受棕榈酸盐(Cys181和Cys184),而NRAS只有一个Cys181。尽管KRAS的最佳剪接变体KRAS4B不经历棕榈酰化,另一种剪接形式KRAS4A在Cys180位点被棕榈酰化。棕榈酸酯与RAS通过不稳定的硫酯键连接,这种修饰很容易逆转。
一种能够修饰RAS的棕榈酰酰基转移酶(PAT)最近被鉴定为DHHC9-GPC16(含有9 -高尔基复合体相关16kda蛋白的DHHC结构域)复合体,它是酵母Erf4-Erf2复合体的同源物。DHHC9-GPC16是25个PATs家族的成员之一,这些PATs均含有DHHC基序,但其亚细胞定位和底物特异性不同。尽管这个家族的所有成员都有DHHC序列,但大多数成员没有类似于GPC16的结合性伴侣。敲除研究表明DHHC9-GPC16并不是唯一对RAS65有活性的PAT。DHHC9和其他含有DHHC序列的该酶家族成员是跨膜蛋白。因此,CAAX处理RAS蛋白,使其对细胞膜具有一定的亲和力,这似乎是棕榈酰化的先决条件。然而,缺乏CAAX Cys的酿酒酵母RAS突变体仍然可以被棕榈酰化,这表明至少在酵母中,棕榈酰化并不绝对需要异戊烯化。
NRAS和HRAS从膜内系统转运到质膜需要棕榈酰化(图3)。RAS的棕榈酰化发生在高尔基体的细胞质表面,同时DHHC9-GPC16也位于此。法尼酰化RAS对细胞膜的亲和力很低,但是法尼酰化和棕榈酰化RAS的亲和力是前者的100多倍,因此高尔基体RAS的棕榈酰化作用是蛋白质的亲和力陷阱。双脂化蛋白与细胞膜的高亲和力结合通过囊泡转运促进其亚细胞转运。
多碱性区域作为KRAS4B的第二个信号
KRAS4B在RAS蛋白中是独一无二的,因为它不能被棕榈酰化。然而,和所有CAAX蛋白一样,它仍然需要第二个信号才能转运到质膜。KRAS4B第二信号由HVR中一个带8个正电荷的Lys丰富域组成。因此,尽管不需要PTM来创建第二个信号,但这里考虑PTM序列是因为它补充了法尼酰化,并且本身可以被PTM修饰。多碱性区域与所述质膜内小叶带负电荷的头基(headgroups)形成静电相互作用。无论是单独的静电相互作用,还是RAS上的法尼酰基插入磷脂双层膜,都不能提供足够的亲和力来实现稳定的膜缔合,但这两种相互作用共同提供了足够的亲和力来实现相对稳定的膜缔合。虽然KRAS4B的稳态分布主要出现在细胞膜上,但对活细胞的分子捕获研究表明,KRAS4B与细胞膜的相互作用是动态的。
棕榈酰化-去棕榈酰化循环
与法尼酰化不同,棕榈酰化在生理条件下是可逆的。事实上,超过25年前的研究表明,棕榈酸酯在RAS上的半衰期比蛋白质的半衰期短得多。最近,人们发现NRAS和HRAS经历着酰化-去酰化的循环,这个循环与RAS在高尔基体之间的转运有关(图3)。高尔基体向质膜的顺行转运需要棕榈酰化,并通过囊泡转运进行。DHHC9-GPC16在高尔基体上的定位以及双脂化蛋白被膜亲和力捕获支持了这个模型。(Photobleaching)光漂白和光激活研究表明,RAS从质膜逆行转运到高尔基体需要去丙二酰化,但因为这种修饰发生太迅速而不能在囊泡转运中发生。这些观察结果支持当前的模型, 这个模型认为NRAS和HRAS在高尔基体上被棕榈酰化,并因此被亲和诱捕在膜组分上,通过小泡运送到质膜,一段时间后在质膜上发生去棕榈酰化并被释放到胞质(图4)。从细胞溶质,RAS蛋白可以扩散到高尔基开始新一轮的棕榈酰化和返回到质膜。来自高尔基体的RAS信号与来自质膜的RAS信号在相对下游通路参与方面存在差异,而在T淋巴细胞的生物学结果中,有证据表明,酰基化-二酰基化循环是调节信号的一种方式。
没有证据表明由DHHC9-GPC16或任何其他PAT介导的RAS棕榈酰化是受到调控的,这表明,像法尼酰化一样,棕榈酰化是翻译后的管家修饰,尽管这个领域尚未得到充分研究。相比之下,有证据表明,去丙二酰化是由GTP介导的HRAS调控。因此,阐明去丙二酰化的调控模式在一定程度上取决于确定棕榈酸盐的去除机制。棕榈酸酯和其底物之间的硫酯键非常不稳定,有一种观点认为,去丙二酰化可能不是酶作用的。另一种观点认为,有一个或多个RAS特异性棕榈酰硫酯酶催化水解反应。其中一种可能是酰基蛋白硫酯酶1(APT1)。然而,这种蛋白有许多其他底物,并已在胞浆中被发现,这就提出了一个问题,它如何接近与膜结合的棕榈酸修饰RAS。最近,一项高度创新的研究使用了具有可切割或不可切割酰基修饰的半合成RAS蛋白,并得出结论,尽管RAS只能在高尔基体上进行棕榈酰化,但细胞中的任何地方都可能发生去棕榈酰化。这提示了一个模型,通过限制高尔基体上的棕榈酰化定位和单向矢量囊泡转运,可以克服原本会将RAS分布在所有细胞内膜上的熵。
图1 | RAS信号。RAS的GDP-GTP循环。不活跃的、与GDP结合的RAS被鸟嘌呤核苷酸交换因子(GEF)激活,GEF诱导GDP的释放,从而允许GTP结合。GTP装载引起RAS中显著的构象变化,使其能够通过其RAS结合域(RBDs)结合效应器(effectors)。RAS的“打开”状态受到其固有的缓慢GTPase活性的限制,通过与GTPase激活蛋白(GAP)的结合,可以将其加速到105倍,使RAS恢复到其不活跃的、与GDP结合的状态。b |细胞外信号调节激酶(ERK)通路。这一途径是由蛋白Tyr激酶受体(PTKRs)介导的,该受体由生长因子的结合激活。适配器蛋白生长因子受体结合复合物2 (GRB2)与活化(即磷酸化)RTKs结合。GRB2还能与Son of sevenless(SOS)的GEF结合,并将其带到细胞膜上,从而激活RAS。RAS通过将RAF1带到细胞膜并激活其激酶活性来启动下游信号。这是最具特征的RAS调控通路,在癌症中经常失调。c |对RAS的多路调节,并从RAS发出信号。改图显示了用于调节RAS或从RAS·GTP传输信号的GEFs、gap和效应器的各家族。钙促进的RAS抑制剂;GAP1IP4BP, GAP1InsP4-结合蛋白;MEK, MAPK / ERK激酶;NF1, 神经纤维瘤蛋白 1;磷脂酶CεPLCε;PI3K,磷酸肌醇3-kinase;RALGDS, RAL鸟嘌呤核苷酸解离刺激剂;RASALRASGAP-activating-like;RASGRF, RAS-specific guanyl-核苷酸释放因子;RASGRP, ras特异性鸟嘌呤核苷酸释放蛋白;RASSF, RAS协会包含领域的家族;RIN1, RAS和RAB相互作用体1;SYNGAP突触RASGAP;TIAM1,T淋巴瘤的侵袭和转移诱导1
图2. RAS基因C端膜靶向区PTM。本图给出了四种RAS亚型的高变区(HVRs)。这些序列包含了将不同的RAS蛋白靶向到不同的亚细胞膜区所需要的所有信息,事实证明,它们可以以同样的方式单独用于靶向不相关的蛋白。CAAX序列通常被认为是“第一个信号”,因为位于该序列上游的“第二个信号”也需要质膜靶向。对于HRAS、NRAS和KRAS4A,第二个信号由棕榈酰化的Cys残基组成。对于KRAS4B,第二个信号由一个净正电荷为8的多碱性区域组成。CAAX序列的Cys残基用黄色表示。由棕榈酸酯修饰的第二个信号区域的Cys残基用绿色表示。KRAS4B多碱性区域的Lys残基为粉红色,磷酸化的主要位点Ser181为蓝色。b | CAAX的加工是由三种依次起作用的酶催化的:法尼酰基转移酶(FTase)、RAS -转换酶1 (RCE1)和异丙基半胱氨酸羧甲基转移酶(ICMT)。FTase是一种胞质酶,催化序列中的第一个反应,也是限速反应。RCE1是一种内质网(ER)定位内蛋白酶,去除AAX氨基酸,使法尼半胱氨酸成为新的羧基端。ICMT也定位于ER膜,以甲基酯化法尼酰半胱氨酸α-C端基团。该反应以s -腺苷蛋氨酸(AdoMet)为甲基供体,生成s -腺苷同型半胱氨酸(AdoHcy)。这些修饰的最终结果是将RAS蛋白的C端从亲水结构域转化为脂化的疏水结构域,其中C端羧酸盐的电荷被甲基化所抵消。由FTase和RCE1催化的反应是不可逆的,而由ICMT催化的异戊烯半胱氨酸羧甲基化在生理pH值下是很容易可逆的,尽管还没有确定一种特定的酯酶催化相反的反应


本文作者 :杨爱民课题组CQU

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