嘧啶氧磷

理解原理"搞定"基毒,基因毒性杂质和DNA反应机理全面解读

作者:药研进化论 / 关注公众号:Pharmaspace  发布:2019-10-26

关注"药研进化论"升职加薪&热爱生活遗传毒性致癌物发生致癌和致突变的作用,第一步一般认为都是和DNA发生反应。从机理上理解基因毒性杂质的作用原理,不用死记硬背,就能轻松记住所有的基因毒性杂质。
根据Miller的理论:致癌物要么是亲电试剂,要么可以代谢成亲电试剂。然后和DNA的亲核基团发生反应。DNA的亲核活性基团主要有:碱基上的氮碱基上的氧磷酸酯骨架先来看一下DNA的结构双螺旋的DNA主要含有四个碱基,分别是腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶以及磷酸酯的串联骨架。这些嘧啶和嘌呤上面的氮氧都富有电子,如果遇见一些缺电子的试剂,很容易发生取代等反应。事实上,DNA的反应种类除了只反应某一处位点外,还会有一些比较复杂的反应类型:可以看到有的碱基上不仅含有一个亲核位点,如果一个致癌物有两处亲电位点,反应一处后,还会和碱基的另外一个位点反应,生成一些小环。双亲电基团的另外一个基团也有可能和两个不同的碱基链接,甚至可以和两个螺旋上的不同碱基链接。也会有可能另外一个基团和蛋白质反应,造成DNA-蛋白质的链接。DNA的反应活性除了亲核性之外,主要受空间结构的影响。Guanine中的N7位置位于DNA双螺旋的大沟槽处,空间较大,容易和亲电试剂接触,反应活性显然要比Adenine中处于小沟槽中的N3(红色数字)要高。当然根据结构也能预知,Adenine的N1和Cytosine的N3(绿色数字)位置处于狭窄的分子空间内,又有氢键相连,所以基本上没有反应活性。DNA反应并不都是反应在氧和氮上,比如粉红色的C8位置也能发生反应,不过该反应也是先和相邻的N7反应然后重排到C8。纯粹的理论说明略显枯燥,下面会详细介绍每一类含有警示结构的致癌物。
酰化试剂
酰基卤化物酰基卤化物由于卤原子电负性较大,吸引电子,导致羰基碳非常缺电子,一旦和DNA接触,会和腺嘌呤的羰基氧发生酯化反应。二甲氨基甲酰氯和二乙氨基甲酰氯被IARC归为致癌物2A类。
异氰酸酯类异氰酸酯是具有多种商业应用的高活性化合物。广泛用于制造聚氨酯泡沫、弹性体、涂料、粘合剂、涂料、杀虫剂和许多其他产品。单芳基异氰酸酯是制造药品和农药的重要中间体。观察到胞嘧啶、腺嘌呤和鸟嘌呤的外环氨基上的氨和异氰酸酯反应,胸腺嘧啶未检测到加合物。
烷基化直接作用试剂
磺酸、磷酸酯类烷基化试剂一般烷基为小于5个碳的小分子烷烃,因为烷烃为供电子基团,碳原子越多,给电子能力强,磺酸、磷酸的诱导作用减弱,烷基的亲电变差,反应活性减弱。
磷酸酯中P和C都是亲电位点,和DNA反应主要有两种反应机理:
亲核试剂进攻烷基碳
亲核试剂进攻磷原子
第一种机理是遗传毒性主要的因素,烷基越小反应活性越高。
有机磷农药不仅具有遗传毒性,还有神经毒性。通过一些数据已经观察到有机磷杀虫剂可以使Guanine的N7位置烷基化。
磺酸酯类主要是通过使DNA烷基化发挥遗传毒性。
烷基化的反应机理分为两种:
通过SN1反应机理,一般是小分子烷烃,比如磺酸甲酯、磺酸乙酯。DNA烷基化的主要位点是鸟嘌呤的N7。
通过SN2反应机理,一般是支链烷烃,比如磺酸异丙酯。DNA烷基化的主要位点是鸟嘌呤的O6。值得着重介绍一下的是Busulfan,白消安,1,4-双(甲基磺酰氧)丁烷。是一种双功能烷化剂,可以和两分子鸟嘌呤反应产生鸟嘌呤-鸟嘌呤桥,将DNA相互交联。
N-羟甲基衍生物该类物质属于代谢后产生活性甲醛,发挥遗传毒性。
甲醛属于高活性致癌物,会和DNA发生多种反应。详见后面醛类遗传毒性杂质。
硫芥和氮芥硫芥和氮芥的反应机理类似。首先是一个氯原子离去,形成氮杂环丙烷1,然后被鸟嘌呤的N7位开环成2,另外一个氯原子离去,再次形成氮杂环丙烷3,3可以被水开环成4,也可以和另外一分子的鸟嘌呤反应,成两分子交联。正是由于它们可以诱导DNA链间交联,使DNA丧失了复制能力,所以导致高度的遗传毒性和细胞毒性。
β-内酯和γ-磺酸内酯β内酯四元环具有很大的张力能,因此遇到亲核试剂很容易开环。和DNA的反应主要发生在鸟嘌呤的N7处以及腺嘌呤的N1处,生成羧乙基衍生物。γ-磺酸内酯反应类似。
环氧化物和氮杂环丙烷环氧乙烷是常见的环境污染物,会产生很大的人类直接或间接暴露。环氧乙烷活性较高,两个碳原子均可以发生反应。最常见的和DNA中的氮反生亲核开环反应,生成β-羟乙基衍生物。主要反应位点:胞嘧啶N3腺嘌呤N1和N3鸟嘌呤N7磷酸酯和磷酸酯的烷基化会导致DNA断裂
氮杂环丙烷和环氧反应类似。
卤代脂肪族类试剂遗传毒性的潜力取决于卤素的性质、数量和位置以及化合物的分子大小。甲基溴和甲基碘化物已被证明能直接烷基化关键大分子,如蛋白质和DNA。一卤甲烷的肝脏代谢的第一步是与谷胱甘肽(GSH)结合,导致S-甲基谷胱甘肽的形成。这种物质最终可能转化为甲硫醇,后者被认为是有毒的代谢物。或者,甲醛的产生可能导致细胞损伤。甲醛可能来源于细胞色素P450直接氧化母体化合物或甲硫醇的代谢。二卤代烷烃通常通过谷胱甘肽或者细胞色素P450代谢后活化,产生遗传毒性。比如1,2-二氯乙烷作为一类试剂,被GSH活化形成硫芥类中间态,和鸟嘌呤反应,引发遗传毒性。
三卤代烷烃容易被P450氧化活化,产生光气,光气是一种高活性的亲电中间体。
完全卤代烷烃倾向于自由基机理反应。四氯化碳在P450中被还原成三氯甲基自由基,该自由基和DNA之间的加合物是导致肝癌的主要原因。
三氯甲基自由基也可以和氧气反应,生成光气。
亚硝酸烷基酯亚硝酸酯和DNA的作用机制尚不明确,一般有两种观点:亚硝酸酯和DNA上的氮发生酯交换反应DNA和亚硝酸酯的烷基部分发生烷基化反应虽然作用机制不明确,但是亚硝酸酯类具有遗传毒性已经被很多证据证实。
α,β-不饱和羰基α,β-不饱和羰基作为活泼的迈克尔受体,很容易被亲核试剂进攻β碳或者羰基碳。和DNA的反应形式多样,以鸟嘌呤为例进行说明。鸟嘌呤的环外胺基首先发生迈克尔加成,得到化合物1,化合物1有两种反应途径:酰胺处的胺基进攻羰基,得到环合的半缩醛2裸露的羰基和另外一分子鸟嘌呤进行缩合反应,然后酰胺进攻亚胺环合得到交联的5.
小分子醛小分子醛的反应活性高,均会和DNA中的胺基反应生成席夫碱。
最小的醛为甲醛,反应活泼。是一种广泛使用的化学品,常用作防腐剂、消毒剂、树脂和化工品的原料。在环境中广泛存在。目前通过动物和人体实验已经证实,甲醛具有很强的细胞毒性和遗传毒性。常引起DNA和蛋白质交联,是导致遗传毒性的主要原因。乙醛和鸟嘌呤生成席夫碱1,1被还原得到2,如果1继续和乙醛缩合得到3.化合物3也会像不饱和醛一样环合得到4.化合物4可以导致DNA编码错误并抑制DNA合成。没有环合的5和另外一分子的鸟嘌呤反应得到交联的6.小分子醛的遗传毒性的主要原因就是4和交联的6引起DNA损伤。
醌类醌类即是亲电试剂也是氧化试剂,容易被还原成酚。醌遗传毒性的两个主要机理是:亲核剂的烷基化。由于醌本身也是迈克尔受体,易于被亲核试剂进攻,可以和蛋白质上GSH、半胱氨酸烷基化。氧化还原反应。它们可以与相应的半醌自由基进行酶促(即细胞色素P450/P450还原酶)和非酶氧化还原循环,导致ROS的形成,包括超氧阴离子,过氧化氢,并最终形成羟基自由基。ROS是造成衰老和癌变的主要元凶。
烷基化间接作用试剂
单卤代烯烃卤代烯烃经过P450代谢后会被氧化成环氧化合物,然和和DNA反应诱导癌变。多卤代烯烃的反应更为复杂,三氯代乙烯经过P450代谢可以生成酰氯、环氧、氯代醛,这些物质均会诱导癌变。
肼类肼作为药物种类很多:异烟肼治疗结核苯乙肼抗抑郁丙咔嗪用于治疗Hodgkin’s但是含肼药物的主要副作用就是致癌、肝毒性和诱导红斑狼疮。该类物质通过P450中氧化酶的催化,肼被氧化成偶氮类化合物。然后反应生成一系列碳正离子、自由基等活性物质,最终导致DNA烷基化,诱导癌变。
脂肪族偶氮化合物该系列化合物是肼的氧化中间体,见上图。
作用机理一致。
氨基甲酸酯和硫代氨基甲酸酯具有代表性的分子是氨基甲酸乙酯(乌拉坦)。是一种已知的多部位致癌物,能够在各种器官和动物物种中诱导肿瘤。乌拉坦以往被用作催眠剂,以及用于治疗包括慢性白血病、多发性骨髓瘤和静脉曲张在内的一系列疾病。在商业上,氨基甲酸乙酯被用作杀虫剂、熏蒸剂和化妆品的助溶剂。氨基甲酸乙酯也是发酵过程的副产品,在烟叶和烟雾中发现。目前,人类暴露于氨基甲酸乙酯的最大风险是通过饮用酒精饮料和发酵食品。乌拉坦在体内的代谢主要有两种途径:解毒途径通过一些酶的催化,代谢成低毒性的乙醇、二氧化碳和氨气。生物途径P450催化的氨基甲酸乙酯发生氧化,脱氢生成氨基甲酸乙烯酯,随后生成环氧化物氨基甲酸乙烯酯。氨基甲酸乙烯酯环氧化物被认为是氨基甲酸乙酯的最终致癌代谢物,能够与DNA结合并产生诱变。硫代氨基甲酸酯主要用作除草剂。硫代氨基甲酸酯已被证明通过S-氧化进行代谢生物活化,形成活性亚砜和砜中间体,它们是强有力的氨基甲酰化试剂。已经观察到硫代氨基甲酸酯暴露与结肠癌和白血病之间存在正相关。
N-亚硝胺化合物N-亚硝胺化合物代表一类非常稳定的化学致癌物。很多种N-亚硝胺在各种动物物种中已经被证实具有致癌作用。
广泛存在于食品、饮用水、化妆品和农药中。
N-亚硝胺需要代谢活化产生基因毒性的原因主要有两方面:
代谢得到活性烷基和大分子(DNA或者蛋白质)烷基化是产生遗传毒性和致癌性的主要原因
代谢得到的小分子醛会进一步和DNA结合造成额外的损伤N-亚硝胺是属于基因毒性杂质的重点关注对列,有着更加严苛的质量控制标准。有代表性的是NDMA在缬沙坦中的限度被要求限制到<0.3ppm。
叠氮和三氮烯类三氮烯的致突变作用机理是:代谢后导致DNA的烷基化。化合物1通过细胞色素P450酶的代谢氧化得到羟甲基三氮烯(2),羟甲基三氮烯(2)通过脱除甲醛产生单甲基三氮烯(3)。3能够通过产生甲基重氮离子(4)来甲基化DNA和RNA。
N-硝基胺化合物硝基脂肪胺的致癌作用机理尚不明确,主要有两种观点:还原活化:硝基胺化合物通过还原作用生成亚硝基、偶氮、胺等活性基团,参与DNA反应氧化活化:含甲基胺硝基化合物氧化后降解出甲醛,作为活性试剂导致癌变α,β-不饱和脂肪族醚致癌物黄曲霉素的关键组成结构,并被认为是黄曲霉素发生癌变的主要关键基团。黄曲霉素B1通过P450活化后产生环氧化物,被DNA中的亲核N开环,产生遗传毒性。
DNA加合物 间接作用试
多环芳烃
具有平面高度共轭芳香结构的多环芳烃(包括杂环芳香族化合物),需要代谢活化才能发挥其致突变/致癌作用。主要有以下三种作用机理:
1.最普遍接受的激活多环芳烃的反应机理涉及二醇-环氧化物的形成。细胞色素P450单加氧酶的初始环氧化,然后是环氧化物水合酶(EH)介导的水解为反式二醇,以及相邻双键的第二次环氧化。活性产物会引起DNA的烷基化PAH二醇环氧化物形成有害DNA加合物的能力依赖于环氧基的位置。邻近“Bay”或“Fjord”区域的末端环氧化产生高度诱变性和致瘤性化合物。
2.多环芳烃代谢活化以引发癌症的另一机理是细胞色素P450单电子氧化,产生自由基阳离子。自由基阳离子在苯环中有两种存在形式:给单子对位(路径1) ,DNA进攻对位苄基位置(路径2) ,DNA进攻苄基位3.第三条PAH活化途径,涉及二氢二醇脱氢酶(DDs)催化形成高活性和氧化还原性物种--邻醌。中间生成多种ROS,如超氧自由基和过氧化氢自由基。最后得到的化合物4,也是一个迈克尔受体,都会引起DNA损伤。
杂环多环芳烃作用机理类似于多环芳烃。都需要代谢活化,唯一不同的一条路径是杂环多环芳烃有可能经历N杂环的氧化。
香豆素和呋喃香豆素香豆素的致癌机理目前尚不清楚。
在人类中,香豆素主要由P450代谢为7-羟基香豆素(5),7-羟基香豆素(5)作为葡萄糖醛酸和硫酸盐结合物在尿中排泄。
在啮齿动物中,香豆素代谢的主要途径是通过香豆素3,4-环氧化物(1),导致形成包括邻羟基苯乙醛(2),邻羟基苯乙醇(3)和邻羟基苯乙酸(4)在内的开环代谢物。
具体和DNA的反应机理还没有定论。
呋喃香豆素是DNA的交联试剂。该系列化合物结构中具有两个光活性双键,当用长波长紫外光照射时,会发生【2+2】环加成反应,导致DNA交联。
含氮芳香环和DNA的加合物间接作用试剂
亚硝基芳香化合物
含有芳香胺、硝基、亚硝基或羟胺基团的化合物,活化机理有相似性。
一般都经过芳香羟胺中间体,通过酶促活化,最终产生亲电物种,和亲核的DNA产生加合物。
亚硝基的作用机理略有不同:芳香羟胺被不同的酸活化,产生苯胺正离子的活性亲电物种,然后和DNA加和。芳香N-O化物虽然其作用机理尚不完全清楚,但芳香族N-氧化物被发现是各种致癌物的重要组成部分。
硝基芳烃硝基芳香化合物的代谢活化涉及到硝基的单电子还原,以产生共振稳定的硝基阴离子自由基。在有氧条件下,自由基可以还原分子氧,形成超氧阴离子,产生各种和DNA反应的活性氧物种。在厌氧的环境中,硝基阴离子自由基可以进一步还原为亚硝基、羟胺和胺。进一步活化羟胺产生反应性硝离子
芳香胺芳香胺必须代谢为反应性亲电试剂,才能发挥致癌作用。对于芳香胺和酰胺,这通常涉及N-羟基芳胺和N-羟基芳酰胺的初始N-氧化。这是由细胞色素P450介导的。在通过酶的酯化作用进一步活化,形成活性亲电物种。最终造成DNA损伤。
芳香重氮化合物偶氮化合物通过其代谢物芳香胺,具有生物活性。
常见非遗传毒性的致癌物这些化合物不会直接和DNA反应,但是由于强烈的致癌作用也会在药品标准中需要着重关注。
硫代羰基化合物IARC将其归类于非遗传毒性,但是该类化合物具有致癌、致畸和促甲状腺肿等危害。
聚合卤代环烷烃提出了几种致癌作用机理但并非和DNA的直接作用。(I)抑制细胞间通讯(Ii)粗面内质网脱颗粒(Iii)激素失衡
卤代苯、二甲苯卤代芳香化合物的致癌性机理尚不完全清楚。然而,它们被认为是通过非遗传毒性机制而不是直接作用于DNA,发挥致癌作用。二噁英属于该类致癌物质。当然以上信息并非都是最终确论,有些是经过体外实验数据。如果有些警示结构的基因毒性杂质实在无法控制,还可以进行Ames实验,如果证实是阴性则可以视作普通杂质,如果Ames实验属于阳性,实验过程中无法研究控制,还可以通过人体实验,当然这种实验实在万不得已才选择用。最好的方法是通过QbD理念从源头控制,尽量不要使用一些潜在遗传毒性物质,无法避免可以使用清除因子等科学方法合理控制。
参考文献:
Mechanisms of Chemical Carcinogenicity and Mutagenicity: A Review
with Implications for Predictive Toxicology
DOI:10.1021/cr100222q
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本文作者 :药研进化论

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